本试剂盒用于新型冠状病毒(2019-nCoV)的定性检测,采用咽拭子、鼻咽拭子、支气管肺泡灌洗液、痰液。本品检测结果仅供临床参考,不得作为唯一为临床诊治提供依据。建议结合患者的临床表现及其他实验室检查,综合分析病情。
该试剂盒基于一步法 RT-PCR 技术。事实上,我们选择了2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的ORF1ab和N基因作为扩增靶区。特异性引物和荧光探针(N基因探针用FAM标记,ORF1ab探针用HEX标记)设计用于检测样本中的2019新型冠状病毒RNA。该试剂盒还包括内源性内控检测系统(CY5标记的内控基因探针),用于监控样本采集、RNA和PCR扩增的过程,从而减少假阴性结果。
成分 | 体积(48吨/套) |
RT-PCR反应液 | 96微升 |
nCOV引物TaqMan探针混合物(ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene) | 864µl |
阴性对照 | 1500微升 |
nCOV阳性对照(l ORF1ab N基因) | 1500微升 |
自备试剂:RNA提取或纯化试剂。阴性/阳性对照:阳性对照为含有目的片段的RNA,阴性对照为无核酸水。在使用过程中,它们应参与提取,并应被视为具有传染性。应按有关规定处理和处置。
内参基因是人 RnaseP 基因。
-20±5℃,避免反复冻融5次以上,有效期6个月。
配有FAM/HEX/CY5等多道荧光PCR仪。
1.适用标本类型:咽拭子、鼻咽拭子、支气管肺泡灌洗液、痰液。
2.标本采集(无菌技术)
咽拭子:用两个拭子同时擦拭扁桃体和咽后壁,然后将拭子头浸入盛有采样液的试管中
痰液:患者深咳后,将咳出的痰液收集在盛有取样液的螺口试管中;支气管肺泡灌洗液:由医疗专业人员取样。3.样品的储存和运输
用于病毒分离和RNA检测的标本应尽快进行检测。24小时内可检测的标本可4℃保存;24内检测不到的
小时应在-70℃或以下储存(如果没有-70℃的储存条件,则应
暂存于-20℃冰箱)。标本在运输过程中应避免反复冻融。标本采集后应尽快送至实验室。如果样品需要长距离运输,建议使用干冰储存。
1 样本处理及RNA提取(样本处理区)
建议取 200μl 液体样品进行 RNA 提取。相关提取步骤参见市售RNA提取试剂盒说明书。阴阳两面
该试剂盒中的对照参与提取。
2 PCR试剂制备(试剂制备区)
2.1 从试剂盒中取出所有组分并在室温下解冻和混合。使用前以 8,000 rpm 离心几秒钟;计算所需试剂用量,反应体系如下表配制:
成分 | N 份(25µl 系统) |
nCOV 引物 TaqMan 探针混合物 | 18 微升 × N |
RT-PCR反应液 | 2 微升 × N |
*N = 测试样本数 + 1(阴性对照)+ 1(nCOV阳性对照) |
2.2 各组分充分混匀后,短时间离心,使管壁上的液体全部落到管底,然后分装20 μl扩增系统到PCR管中。
3 取样(试样制备区)
提取后加入 5μl 的阴性和阳性对照。将待测样品的RNA加入PCR反应管中。
盖紧管子并以 8,000 rpm 的速度离心几秒钟,然后将其转移到扩增检测区域。
4 PCR扩增(扩增检测区)
4.1 将反应管放入仪器样品池中,设置参数如下:
阶段 | 循环 数字 | 温度(摄氏度) | 时间 | 收藏地点 |
撤销转录 | 1 | 42 | 10分钟 | - |
预变性n | 1 | 95 | 1分钟 | - |
循环 | 45 | 95 | 15s | - |
60 | 30多岁 | 数据采集 |
仪器检测通道选择:选择荧光信号的FAM、HEX、CY5通道。参考荧光NONE,请不要选择ROX。
5 结果分析(设置请参考各仪器实验说明)
反应结束后,保存结果。分析后,根据图像调整基线的起始值、终止值、阈值(用户可根据实际情况调整,起始值可设置为3~15,终止值可设置为5~20,调整)在对数图中的阈值窗口,阈值线处于对数相位,阴性对照的扩增曲线为直线或低于阈值线)。
6 Quauty control(检测中包含一个procedural control) 阴性对照:FAM、HEX、CY5检测通道无明显扩增曲线n
COV阳性对照:FAM和HEX检测通道扩增曲线明显,Ct值≤32,CY5通道无扩增曲线;
以上要求必须在同一实验中同时满足;否则,实验无效,需要重复。
7 结果的确定。
7.1 如果检测样本的FAM和HEX通道无扩增曲线或Ct值>40,且CY5通道有扩增曲线,则可判断无2019新型冠状病毒(2019-nCoV)样品中的RNA;
.2 如果检测样本在FAM和HEX通道有明显的扩增曲线,且Ct值≤40,则可判断样本为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)阳性。
7.3 如果供试品仅在FAM或HEX的一个通道有清晰的扩增曲线,且Ct值≤40,而另一通道无扩增曲线,则需重新检测结果。如果复检结果一致,则可判定该样本对新冠病毒呈阳性。
冠状病毒 2019 (2019-nCoV)。如果复检结果为阴性,则可判断样本为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)阴性。
采用ROC曲线法确定试剂盒的参考CT值,内控参考值为40。
1.每个实验都应该做阴性对照和阳性对照。只有当控制满足质量控制要求时才能确定测试结果
2.当FAM和HEX检测通道为正时,由于系统竞争,CY5通道(内控通道)的结果可能为负。
3.当内控结果为阴性时,如果试管的FAM和HEX检测通道也为阴性,则表示系统被禁用或操作错误,则试验无效。因此,样品需要重新测试。